一、实验准备

人多能干细胞培养基的配制

1. 解冻hPSCMediumSupplement：在2-8℃下解冻，融化后轻轻上下晃动混匀，按需分装并立即使用或存放于-20~-80℃，避免多次冻融。

2. 按1:50比例将10mL hPSCMediumSupplement加入500mL hPSCMediumBasalMedium中，充分混合后即得人多能干细胞培养基（abs9403）。注意混匀后可在2-8℃下保存2-3周，超过3周不宜使用。

3. 实验试剂平衡：人多能干细胞培养基在实验前需室温光避开平衡；PBS及消化液等需加热至37℃，注意培养基中的因子不可进行37℃水浴加热。

1. 基质胶包被培养板：取6孔板或12孔板，每孔加1mL或0.5mL即用型基质胶（abs9410），轻轻摇动使其覆盖底部，置于37℃培养箱中孵育1至2小时，实验前需在超净工作台上室温平衡20分钟。如果暂时不使用，可用Parafilm密封，在2-8℃下保存，并在一周内使用。

2. 将2-3mL的干细胞培养基加入15mL离心管中备用。

3. 解冻细胞：迅速将冻存管从液氮中取出，浸入37℃温水中，轻轻摇动以求在1至2分钟内快速解冻，尽量避免细胞在室温下暴露太久。

4. 离心处理：将解冻的冻存液逐滴加入含培养基的15mL离心管中，平衡后以1000rpm离心3分钟。

5. 重悬细胞：离心后弃去上清，加入1mL人多能干细胞培养基，对沉淀均匀吹吸混匀，进行3至5次的吹吸操作。

6. 接种：吹吸均匀后，弃去平衡好的即用型基质胶，将混合好的干细胞悬液加入包被好的6孔板中，每孔补全至2mL培养体系。

7. 培养：接种后的6孔板可在倒置相差显微镜下观察细胞密度和团块大小，确保呈现出4个细胞以上的团块更为合格。轻轻摇动6孔板，以使细胞均匀分布。将其置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，第二天观察细胞的贴壁情况。

8. 换液：从复苏时开始，每24小时更换一次培养基。由于培养基中的活性成分仅能维持一天，因此需及时更换新鲜培养基。

1. 清洗：移除原有培养基，加入1mL PBS缓冲液，轻轻晃动后吸去PBS。

2. 消化：向6孔板中加入2mL人多能干细胞消化液（abs9409）覆盖底部，放入37℃培养箱中消化2至5分钟，依据细胞生长密度适当调整消化时间。

3. 吹打：消化完成后加入2mL人多能干细胞培养基，轻柔地吹打3-5次，使细胞脱落，并转移至15mL离心管中。

4. 离心：以1000rpm离心3分钟，弃去上清。

5. 接种：用干细胞培养基轻柔吹打细胞，吸掉包被培养板中的基质胶，然后将细胞悬液加入培养板中，补全至每孔2mL培养体系。

6. 换液：自传代时刻开始，每24小时更换培养基一次。

1. 清洗、消化和吹打步骤同前述内容。

2. 离心后弃去上清，加入2mL ES/iPS细胞冻存液（abs9412），对细胞沉淀轻柔混匀后转移至冻存管中，获取冻存液时应及时放回4℃冰箱。

3. 在冻存管上标记细胞种类、冻存时间、操作人员及细胞批次。

4. 置于-80℃冰箱冻存，注意冻存管应直立放置，不可斜放或横放。

5. 24小时后，将-80℃冰箱中的细胞转移至液氮中进行长期冻存。

在整个操作过程中，确保遵循无菌操作标准，以保障实验结果的可靠性与细胞活性。遵从金年会金字招牌诚信至上的原则，科学严谨地执行每一步骤，为细胞研究提供最优质的服务。