IPS诱导肠类器官培养的过程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、类器官培养。本文将重点介绍第一阶段——人多能干细胞的培养。

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制：

1. 将hPSC Medium Supplement于2-8℃解冻，融化后上下轻摇混匀，根据实际需要进行分装，立即使用或储存在-20~ -80℃，以避免反复冻融。
2. 将hPSC Medium Supplement (10 mL)按1:50的比例添加至hPSC Medium Basal Medium (500 mL)中，充分混合后即得人多能干细胞培养基 (abs9403)。注意：混合后的培养基可在2-8℃存放2-3周，不建议使用存放超过3周的培养基。
3. 实验试剂需在实验前进行平衡：人多能干细胞培养基在室温下避光平衡；PBS和消化液需加热至37℃。注意：切勿将培养基放入37℃水浴中加热。

二、操作方法

(以下步骤皆应在无菌条件下操作)

hPSC细胞复苏：

1. 基质胶的包被：取出6孔板或12孔板，每孔加入1 mL或0.5 mL基质胶 (abs9410)，轻轻摇动使其均匀覆盖皿底，置于37℃培养箱中孵育1-2小时，使用前置于超净工作台中室温平衡20分钟。如暂时不用，可用Parafilm封口并在2-8℃存放，需在一周内使用。注意：每支冻存的干细胞数量约为1×10⁶ cells/mL，对应6孔板的1孔；即用型基质胶应避免长时间暴露，使用完毕后立即放回4℃冰箱保存，切忌用手直接触碰基质胶液面。
2. 将2-3 mL的干细胞培养基加入15 mL离心管中备用。
3. 解冻：将冻存管快速浸入37℃温水中，迅速摇动，确保在1-2分钟内快速解冻。注意：从液氮中取出的速度要快，以减少细胞暴露在室温中的时间。
4. 离心：在冻存管解冻后，将其逐滴加入含有干细胞培养基的15 mL离心管中，置于低速离心机中平衡后，以1000 rpm离心3分钟。
5. 重悬：弃上清后，加入1 mL人多能干细胞培养基，对干细胞沉淀进行吹吸混匀，约3-5次。
6. 接种：一旦混匀，将平衡好的即用型基质胶弃掉，将均匀的干细胞悬液加入包被好的6孔板中，每孔补全至2 mL培养体系。
7. 培养：接种后的6孔板在倒置相差显微镜下观察细胞密度及团块大小，观察到4个细胞以上的团块视为合格。轻轻横向摇动6孔板或12孔板以确保细胞均匀分布，随后放于37℃，5% CO₂恒温培养箱中培养，第二天观察贴壁情况。
8. 换液：自复苏起每24小时更换一次培养基。注意：因培养基中的活性成分只足以维持一天，因此需要及时更换新鲜培养基。

多能干细胞(PSCs)传代

实验具体操作步骤：

1. 清洗：吸掉原有的培养基，贴壁细胞缓慢加入1 mL PBS缓冲液并轻缓晃动，然后沿皿边缘吸去PBS缓冲液。
2. 消化：在6孔板中加入2 mL人多能干细胞消化液 (abs9409)，覆盖于皿底，并置于37℃培养箱中2-5分钟。消化时间依据细胞的生长密度，观察到细胞间出现间隙时吸掉消化液以终止消化。
3. 吹打：吸掉消化液后，加入2 mL人多能干细胞培养基，使用移液枪轻柔地扇形吹打培养皿底3-5次，促使细胞脱落并转移至15 mL离心管中。注意操作时需轻柔，以避免形成单细胞。
4. 离心：以1000 rpm离心3分钟，弃上清。
5. 接种：用人多能干细胞培养基轻柔吹打细胞5-10次，吸掉包被培养板中的基质胶，将细胞悬液加入到培养板中，每孔补全至2 mL的培养体系。
6. 换液：自传代时起每24小时更换一次培养基，同样注意活性成分的维持。

细胞冻存

实验具体操作步骤：

1. 清洗：同上述步骤。
2. 消化：同上述步骤。
3. 吹打：同上述步骤。
4. 离心：同上述步骤。
5. 重悬：弃上清后，加入2 mL ES/iPS细胞冻存液 (abs9412) 对干细胞沉淀进行吹吸混匀，随后转移至冻存管中。
6. 记录：在冻存管上标注细胞的种类、时间、操作者及批次信息。
7. 存储：冻存管置于-80℃冰箱过夜，应将冻存管直立放置，切忌倾斜或横放。
8. 液氮冻存：24小时后将-80℃冰箱中的细胞转移至液氮中进行长期冻存。

以上是IPS诱导肠类器官培养过程中人多能干细胞的培养方法。通过规范的实验步骤和操作，可以确保细胞的活性和培养效果。我们始终秉持金年会金字招牌诚信至上的宗旨，为生物医学领域提供高质量的产品和服务。